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Assassin's Creed: Brotherhood é continuação direta de Assassin's Creed II e conta com o mesmo protagonista, Ezio Auditore de Firenze. Contudo, agora ele é mestre da seita dos assassinos, e uma das figuras mais notórias e procuradas da época em que vive, a Renascença Cultural italiana, no século XV.
O jogo começa logo após os eventos de "Assassin's Creed II", no ano de 1499, na Itália. A cidade de Monteriggioni está sitiada pelas forças de uma poderosa e gananciosa família, lideradas por César Bórgia, filho de Rodrigo Bórgia - o grande vilão do jogo anterior. Durante a batalha, o tio de Ezio, Mario, é morto e o artefato Maçã do Éden é roubado por César. O jogo salta para o ano de 1503: Ezio agora é um mestre assassino que procura por vingança e vai para Roma lutar contra os Templários.
A narrativa de "Brotherhood" empresta muita coisa da história italiana real, dando continuidade no que foi mostrado no título anterior. César Bórgia foi um príncipe italiano da Renascença europeia, filho de Rodrigo Bórgia, que foi o Papa Alexandre VI. César era conhecido por ser um homem conquistador de mulheres, calculista e violento. Ele também serviu de modelo para o livro "O Príncipe", de Nicolau Maquiavel.
Apesar das semelhanças com "Assassin's Creed II", o jogo apresenta algumas inovações em sua mecânica, como novos movimentos, combos e contra-ataques, uma inteligência artificial melhorada e mais agressiva, assim como mais armas, a exemplo de uma besta e um canhão, indicando que as armas agora não apenas cortam, mas podem explodir e mandar tudo pelos ares.